2. Частные реакции.

Частные качественные
реакции позволяют обнаруживать в
растворе аминокислоты из определенных
групп (серусодержащие, циклические) или
конкретные аминокислоты (цистеин,
тирозин).

Реакции определения
наличия аминокислот в растворах основаны
на различных химических особенностях,
свойственных тем или иным аминокислотам
или группам аминокислот. Все эти
качественные реакции можно разделить
на несколько групп в зависимости от
химических свойств, на которые они
опираются:

• Реакции на индоловую
  группу (индольное кольцо)

• Реакции на тиоловую
  (сульфгидрильную, -SH)
  группу

• Реакции на фенолы

• Реакции на гуанидиновую
  группу

Ксантопротеиновая
реакция. Тирозин, триптофан,
фенилаланин при взаимодействии с
концентрированной азотной кислотой
образуют нитропроизводные, имеющие
желтую окраску. В щелочной среде эти
нитропроизводные дают соли, окрашенные
в оранжевый цвет.

К исследуемому раствору
прибавляют несколько капель
концентрированной азотной кислоты и
осторожно нагревают. При наличии в
растворе ароматических аминокислот
(или содержащих их белков) появляется
желтое окрашивание.

Реакция
Адамкевича-Гопкинса-Коля (Шульца —
Распайля) на триптофан (реакция на
индоловую группу). Триптофан
реагирует в кислой среде с альдегидами,
образуя окрашенные продукты конденсации.
Реакция протекает за счет взаимодействия
индольного кольца триптофана с альдегидом.
Известно, что из глиоксиловой кислоты
в присутствии серной кислоты образуется
формальдегид:

Растворы, содержащие
триптофан, в присутствии глиоксиловой
и серной кислот дают красно-фиолетовое
окрашивание. Качественная реакция
Адамкевича-Гопкинса-Коля может проводиться
двумя основными способами.

1. Исследуемый раствор
смешивают с равным объемом глиоксиловой
кислоты и к смеси небольшими порциями
прибавляют концентрированную серную
кислоту (объем, приблизительно равный
объему смеси), охлаждая пробирку после
приливания очередной порции. Полученную
смесь оставляют на 10 мин при комнатной
температуре, после чего ставят на 5 мин
в кипящую водяную баню. Наблюдается
образование сине-фиолетового окрашивания.

2. Глиоксиловая кислота
всегда присутствует в небольшом
количестве в ледяной уксусной кислоте.
Поэтому реакцию можно проводить,
используя уксусную кислоту. При этом к
исследуемому раствору добавляют равный
объем ледяной (концентрированной)
уксусной кислоты и осторожно
нагревают до растворения осадка.
После охлаждения к смеси осторожно по
стенке (во избежание смешивания жидкостей)
добавляют объем концентрированной
серной кислоты, равный добавленному
объему глиоксиловой кислоты. Через 5-10
минут на границе раздела двух слоев
наблюдают образование красно-фиолетового
кольца. Если перемешать слои, содержимое
посуды равномерно окрасится в фиолетовый
цвет.

Конденсация триптофана
с формальдегидом:

Продукт конденсации
окисляется до бис-2-триптофанилкарбинола,
который в присутствии минеральных
кислот образует соли, окрашенные в
сине-фиолетовый цвет:

Реакция Вуазена
на триптофан (реакция на индоловую
группу). Сходна с реакцией
Адамкевича-Гопкинса-Коля, также основана
на взаимодействии триптофана с
альдегидами. В кислой среде в присутствии
нитрита натрия и формальдегида индольное
кольцо триптофана дает сине-фиолетовое
окрашивание. В этой реакции триптофан
взаимодействует с формальдегидом как
показано на рисунке выше с образованием
продукта конденсации (бис-2-триптофанилметана),
который окисляется нитритом натрия до
бис-2-триптофанилкарбинола. Последний
в присутствии минеральных кислот
образует соли сине-фиолетового цвета.

К исследуемому раствору
добавляют 1 каплю раствора формальдегида.
К полученной смеси, тщательно перемешивая,
добавляют осторожно по каплям двойной
или тройной объем концентрированной
серной кислоты, охлаждая пробирку. Через
10 минут добавляют, перемешивая, 10 капель
раствора нитрита натрия. Наблюдают
появление сине-фиолетовой окраски.

Реакция Миллона
на тирозин (реакция на фенольную группу).
При нагревании раствора, содержащего
фенолы, с реактивом Милона (смесь нитратов
и нитритов ртути (I) и (П),
растворенных в концентрированной
азотной кислоте, реактив ядовит!)
образуется осадок, окрашенный сначала
в розовый, а затем в красный цвет. Реактив
Милона дает окрашивание почти со всеми
фенолами, в том числе с тирозином, радикал
которого включает фенольное кольцо.

К
исследуемому раствору добавляют
несколько (3-5) капель реактива Милона и
осторожно нагревают. При наличии в
растворе тирозина (или других производных
фенола) наблюдают выпадение окрашенного
в красный цвет осадка в результате
образования ртутной соли нитропроизводного
тирозина. Образование красного раствора
тоже является положительным результатом.
В особых случаях (к примеру, при определении
тирозина в составе некоторых белков)
при проведении реакции Миллона образуется
белый осадок, краснеющий при нагревании,
что тоже считается положительным
результатом теста.

Реакция Паули на
гистидин и тирозин. Реакция
Паули позволяет обнаружить в белке
аминокислоты гистидин и тирозин, которые
образуют с диазобензолсульфоновой
кислотой комплексные соединения
вишнево-красного цвета. Диазобензолсульфоновая
кислота образуется в реакции диазотирования
при взаимодействии сульфаниловой
кислоты с нитритом натрия в кислой
среде:

К исследуемому раствору
прибавляют равный объем кислого раствора
сульфаниловой кислоты (приготовленного
с использованием соляной кислоты) и
двойной объем раствора нитрита натрия,
тщательно перемешивают и сразу прибавляют
соду (карбонат натрия). После перемешивания
смесь окрашивается в вишнево-красный
цвет при условии наличия гистидина или
тирозина в исследуемом растворе.

✒ Тирозин – полезные свойства, побочные эффекты и дозировка — [SAYYES]

Тирозин – это популярная биологически активная добавка, которая используется с целью повышения уровня внимания и концентрации. Данное вещество используется в человеческом мозге для выполнения ряда важных химических процессов, передачи нервных импульсов, а также для регулирования настроения.
 

Несмотря на ряд полезных свойств, использование тирозина в сочетании с некоторыми лекарственными препаратами может вызывать побочные эффекты. Чтобы избежать неправильного использования этой добавки, далее мы рассмотрим основные сведения о ней, рекомендации по использованию и потенциальные риски, связанные с ее злоупотреблением.

Что собой представляет тирозин и для чего он нужен

Тирозин – это аминокислота, которая генерируется в теле человека за счет преобразования другой аминокислоты, имеющей название фенилаланин. Первое соединение встречается в обычных продуктах, доступных каждому. Однако наибольшее его количество наблюдается в сыре, где тирозин обнаружили в первый раз. Это вещество также встречается в курице, рыбе, молоке и продуктах с высоким содержанием белка.

Согласно исследовательским данным, тирозин принимает участие в синтезе ряда важных для человеческого организма веществ, таких как:

Если в вашем рационе недостаточно продуктов с высоким содержанием тирозина, врачи рекомендуют использовать соответствующие пищевые добавки. Добавление их в рацион способно повысить количество дофамина, адреналина и норадреналина, что приведет к улучшению памяти и улучшит реакцию в стрессовых ситуациях и работу мозга.

 

 

 

Влияние тирозина на уровень стресса

 

 

Стресс – это состояние, которое может негативно отразиться на скорости работы мозга, памяти, внимании и передаче нервных импульсов. Так, например, у грызунов, чей организм постоянно подвергался воздействию низких температур, ученые отметили снижение уровня нейромедиаторов, что стало причиной ухудшения памяти. Однако использование добавок тирозина позволило обратить процесс и нормализовать работу мозга у животных. Несмотря на то, что лабораторные исследования на крысах нельзя использовать для утверждения действия вещества в отношении человеческого организма, эксперименты с привлечением людей продемонстрировали аналогичный результат.

Одно из исследований, в котором приняли участие 22 женщины, позволило установить, что добавление в рацион тирозина увеличивает скорость решения задач. Ученые связывают этот эффект с повышением уровня концентрации.

 

 

Другой эксперимент, направленный на изучение влияния соединения на уровень когнитивной гибкости, показал, что тирозин улучшает способность быстро переключаться с одной задачи на другую с сохранением уровня производительности. Помимо этого, было установлено, что регулярное потребление тирозина улучшает работу мозга людей, лишенных сна и сохраняет уровень их концентрации на 3 часа дольше, чем плацебо.

Анализ ряда исследований показал, что добавление в рацион этого соединения способно обратить процесс снижения умственного развития вспять. Также добавка может улучшить распознавательные способности мозга в стрессовых и психологически сложных ситуациях. И несмотря на ряд доказательств того, что тирозин способен улучшать работу мозга, нет ни одного исследования, подтверждающего способность этого соединения повышать уровень физической работоспособности.
 

Также ученые сообщают, что ни одно из проводимых ранее исследований не показало, что tyrosine способен улучшать работу мозга вне стрессовых ситуаций. Иначе говоря, включение в рацион данной добавки не позволит улучшить умственные способности.

 

Тирозин купить в Киеве с доставкой по Украине 

 

Тирозин может использоваться для лечения фенилкетонурии

 

Фенилкетонурия (ФКУ) представляет собой генетическое заболевание, препятствующее процессу синтеза фенилаланингидроксилазы. Данный фермент используется человеческим организмом для генерации нейротрансмиттеров, а также для расщепления фенилаланина.
 

Основным методом лечения данного генетического заболевания является соблюдение специализированной диеты, в состав которой входят продукты с высоким содержанием фенилаланина. Но из-за того, что тирозин синтезируется из данного вещества, лица, страдающие от ФКУ, могут испытывать его острый недостаток. На основании этого ученые пришли к выводу, что добавки тирозина способны улучшить состояние людей с фенилкетонурией.

Анализ исследовательских данных показал, что регулярное использование биологически активных добавок тирозина в сочетании со специализированной диетой для больных ФКУ положительно влияет на рост интеллекта, повышает качество жизни и снижает риск смерти. Однако часть исследований показали, что разницы между использованием добавок и плацебо практически нет. Поэтому сделать однозначные выводы о необходимости использования тирозина при лечении ФКУ нельзя.

 

 

 

Стоит ли использовать l tyrosine при депрессии

 

 

По мнению некоторых исследователей, теразин может помочь людям, находящимся в депрессии. Данное состояние связано с нарушением баланса нейротрансмиттеров в человеческом мозге. Для его лечения, как правило, назначают антидепрессанты, которые способствуют выработке дополнительных нейротрансмиттеров. Но из-за того, что тирозин обладает тем же свойством, его можно использовать как альтернативу антидепрессантам.

Несмотря на это, некоторые ранее проводимые исследования опровергают данное утверждение. Так, в рамках одного из экспериментов, одной группе с депрессией выдавали 100 миллиграммов тирозина на 1 килограмм собственного веса в сочетании с антидепрессантами, а в другой аминокислоту заменили на плацебо. После завершения исследования было выяснено, что тирозин не оказывает никакого влияния на депрессию.
 

Как отмечают врачи, депрессия – это довольно сложное состояние, которое у каждого человека индивидуально. Поэтому использование тирозина при его лечении может помочь далеко немногим. Несмотря на это, включение соответствующей добавки в рацион увеличивает уровень адреналина, дофамина и норадреналина, что обеспечит пользу для организма.

Одно из исследований среди лиц, депрессия которых была вызвана низким уровнем дофамина, показало, что тирозин может улучшить их состояние. У участников эксперимента наблюдалось увеличение количества энергии и повышение мотивации.

Результаты исследований в области изучения влияния тирозина на депрессию противоречивы. Поэтому для определения пользы вещества в данной области потребуются дополнительные эксперименты.

 

 

 

Побочные эффекты от l-тирозин

 

Врачи сообщают, что тирозин – это абсолютно безопасная пищевая добавка при условии использования ее в рекомендуемых объемах, то есть до 150-ти миллиграммов на 1 килограмм собственного веса.   Несмотря на это, в сочетании с некоторыми лекарственными препаратами данное соединение может вызывать нежелательные побочные эффекты.

 

 

Ингибиторы моноаминоксидазы (ИМАО)

 

Тирамин представляет собой аминокислоту, которая способствует нормализации уровня кровяного давления. Она образуется в процессе расщепления тирозина в теле человека, а также может поступать в организм из некоторых продуктов, таких как:

 

сыры с плесенью и твердые; копченое или вяленое мясо; соевые продукты; пиво.

 

ИМАО, которые также часто называют антидепрессантами, блокируют фермент под названием моноаминоксидазу, который способствует расщеплению избыточного тирамина. Это, в свою очередь, может стать причиной повышения уровня кровяного давления до критического состояния.

Но остается неизвестным, может ли тирозин стать причиной накопления тирамина. Поэтому врачи настоятельно не рекомендуют использовать данную добавку в сочетании с антидепрессантами.

 

 

Гормоны щитовидной железы

 

Такие вещества как тироксин и трийодтиронин являются основными гормонами щитовидной железы.  Они отвечают за обмен веществ и рост клеток. Поэтому очень важно, чтобы показатели этих гормонов не превышали допустимое значение и не были ниже его.

Добавление в рацион l-tyrosine может привести к увеличению объемов тироксина и трийодтиронина. Это связано с тем, что данная аминокислота выступает в роли строительного материала для создания гормонов щитовидной железы. По этой же причине лица, принимающие лекарственные препараты для улучшения состояния щитовидной железы, должны быть максимально осторожны при включении тирозина в рацион.

 

 

Леводопа

 

Лекарственный препарат под названием Леводопа часто назначается для лечения болезни Паркинсона. Его активные компоненты конкурируют с тирозином за усвоение организмом в тонком кишечнике, что может негативно отразится на эффективности лекарства. Поэтому врачи рекомендуют принимать добавки тирозина за 2 часа до или после приема лекарственного препарата. При этом исследователи отмечают, что тирозин способен устранить некоторые симптомы заболеваний, связанных с нарушением когнитивных функций.

 

 

 

Рекомендации по использованию тирозина

 

 

В пищевой добавке l-тирозин имеет форму аминокислоты N-ацетил-L-тирозин (NALT). Данная форма вещества отлично растворяется в воде, однако медленно усваивается. Это значит, что объемы NALT, используемые для удовлетворения потребностей организма, должны быть выше, чем чистого тирозина.
 

С целью повышения результативности тренировок последнюю форму вещества рекомендуется включать в рацион в объеме от 500 до 2000 миллиграммов за 30-60 минут до начала физических нагрузок. Для улучшения работы мозга тирозин следует принимать в соотношении от 100 до 150 миллиграммов на 1 килограмм собственной массы.

Использование более высоких объемов добавок может привести к нарушению работы ЖКТ. Поэтому рекомендуемый объем следует разделять на два приема.

 

 

 

Заключение

 

Тирозин является достаточно популярной биологически активной добавкой, которую используют в самых разных целях. Она может применяться для повышения количества нейротрансмиттеров, улучшающих работу мозга в стрессовых ситуациях, а также для увеличения эффективности некоторых лекарственных препаратов.

Как сообщают ученые, данная добавка является абсолютно безопасной. Однако она может взаимодействовать с некоторыми лекарствами. Поэтому перед включением ее в рацион важно проконсультироваться с лечащим врачом.
 

Топ л тирозин в онлайн маркете SAYYES

 

Тирозин, L-Tyrosine, Now Foods, 750 мг, 90 капсул	от 395 грн
Л-тирозин, L-Tyrosine, Puritan’s Pride, 500 мг, 100 капсул	от 232 грн
Л-тирозин, L-Tyrosine 1000, MST Nutrition, 90 растительных капсул	от 370 грн
Тирозин, L-Tyrosine, Thorne Research, 90 капсул	от 585 грн
L- тирозин, L-Tyrosine, Swanson, 500 мг, 100 капсул	от 260 грн

 

ИСТОЧНИКИ

 

• https://www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1863555/
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2738414/
• https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/L-tyrosine

 

Ксантопротеидный тест – определение, принцип, процедура, результат, использование

5 сентября 2022 г. 27 июля 2022 г.

Содержание

Ксантопротеидный тест Определение

Ксантопротеидный тест представляет собой биохимический тест для обнаружения аминокислот , содержащих фенольные или индольные группы, такие как фенилаланин и триптофанин, тирозин). Тест называется ксантопротеидным из-за образования желтого осадка ксантопротеиновой кислоты. Термин «ксанто» означает «желтый», поэтому тест часто называют тестом на желтый белок. Тест дает положительный результат для аминокислот, содержащих бензольные кольца или другие ароматические группы. Тест является качественным тестом, который предоставляет информацию только о наличии или отсутствии аминокислот.

Цели теста на ксантопротеины

• Обнаружение присутствия аминокислот, содержащих ароматические группы, таких как тирозин и триптофан.
• Чтобы отличить тирозин и триптофан от других аминокислот.

Принцип ксантопротеидного теста

Ксантопротеидный тест основан на том факте, что ароматические группы в аминокислотах нитруются при нагревании с концентрированной HNO ₃ с образованием нитропроизводного интенсивного желтого цвета. Однако при добавлении щелочи остаток становится оранжевым из-за образования соли таутомерной формы нитросоединения. Аминокислоты, содержащие бензольное кольцо, такие как фенилаланин, не дают положительного результата в этом тесте, потому что фенильная группа в фенилаланине очень стабильна и не реагирует с азотной кислотой в условиях этого теста. Однако фенилаланин может дать положительный результат после длительного нагревания.

Требования

Реагент

• Концентрированная азотная кислота
• 40% NaOH
• Тестовый раствор

Необходимый материал

• Пробирки
• Подставка для пробирок
• Пипетки

Методика определения ксантопротеидов

1. Около 1 мл раствора пробы отбирают в пробирку. К этому прибавляют такое же количество концентрированной азотной кислоты.
2. Пробирке дают остыть до комнатной температуры. Если образец представляет собой белковый раствор, из-за денатурации белков может образоваться белый осадок.
3. Затем в пробирку добавляют 1 мл 40% раствора NaOH и наблюдают за изменением окраски.

Результат и интерпретация ксантопротеидного теста

• Положительный результат: Появление темно-желтого или оранжевого раствора свидетельствует о положительном результате теста. Это свидетельствует о наличии ароматических групп в белках и аминокислотах.
• Отрицательный результат: Отсутствие темно-желтого или оранжевого раствора свидетельствует об отрицательном результате теста. Это указывает на отсутствие ароматических групп в белках и аминокислотах.

Применение

• Это биохимический тест для обнаружения белков и аминокислот.
• Тест позволяет отличить ароматические аминокислоты от неароматических аминокислот.

Ограничения

• Несмотря на то, что фенилаланин является аминокислотой, содержащей ароматическую группу, он не дает положительного ксантопротеидного теста из-за высокостабильной фенильной группы.

Ссылки

• Нигам С. К. и Омкар (2003). Экспериментальная физиология животных и биохимия. Нью Эйдж Интернэшнл Пвт. Ограничено. Нью-Дели.
• Д (2012). Биохимия. Четырнадцатое издание. Академические издательства. Калькутта.
• Тивари, А. (2015). Практическая биохимия. LAP Lambert Academic Publishing.

Гистохимические методы для демонстрации белков

 

Как партнер Amazon, ConductScience Inc. получает доход от соответствующих закупок

 

Введение

Белки играют жизненно важную роль в каждом жизненном аспекте макромолекул транспортировка молекул, передача сигналов, движение клеток, регуляция экспрессии генов и т. д. Их очистка, локализация и распределение всегда были важной частью большинства биологических исследований.

Существует 22 аминокислоты, которые участвуют в формировании различных белковых структур. Именно третичная структура белка (т.е. трехмерная форма) определяет его функциональные свойства.

Гистохимическая реакция для выявления белков основана на их структурных свойствах (физико-химических, тканевом расположении и аминокислотном составе) ^[5] . Демонстрации, основанные на аминокислотах, могут быть выполнены только в том случае, если аминокислоты, которые должны быть продемонстрированы, (например, триптофан, тирозин, цистеин и т. д.) присутствуют в очень высокой концентрации в тканях. Но, как правило, они присутствуют в низкой концентрации, смешаны со многими другими различными белками, что усложняет их демонстрацию. В этом случае демонстрация белков осуществляется в зависимости от их биологических свойств, таких как ферментативная активность или специфическая антигенность ^[5] .

Перед демонстрацией процесса белка производится фиксация ткани для ее сохранения и предотвращения аутолиза.

Фиксатор

Формальдегид используется в качестве фиксатора для белков, образующих поперечные связи между различными реакционноспособными группами. Эта реакция с формальдегидом обратима, и его поперечные связи могут гидролизоваться при длительной промывке водой ^[5][1] .

Демонстрация

Демонстрация белка основана на двух принципах ^[5] :

• Ковалентная связь между реактивной аминогруппой белка, подлежащего демонстрации, и красителем, который используется для демонстрации. Эта реакция дает образование окрашенного соединения.
• Суммарный заряд белка, подлежащего демонстрации, реагирует с ионами красителя, который используется для демонстрации.

Существуют различные методы демонстрации белков в зависимости от типа аминокислот, которые нужно продемонстрировать, будь то основные (пример: гистидин, аргинин и лизин) или кислые (пример: аспартат и глутамат) ^{[1][9 ]} . Некоторые белки демонстрируются с помощью методов, включающих демонстрацию ароматических аминокислот, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.

Гистохимический метод/методы для демонстрации белков.

Некоторые методы проверяют наличие или отсутствие белка, а некоторые методы позволяют выявить любой конкретный белок или аминокислоты в исследуемом образце.

Тесты на наличие белка

1.    Биуретовый тест

Наличие белка в тестируемом образце часто определяют с помощью биуретового теста. Этот тест специально проверяет наличие пептидной связи. Наличие двух и более пептидных связей дает положительный результат теста.

Принцип: Щелочной CuSO ₄ реагирует с белком, присутствующим в образце, образуя комплекс, который дает продукт фиолетового цвета.

Требования к материалам: Тестовый образец, биуретовый реагент, сывороточный альбумин (для положительного контроля), пипетки, сухие пробирки и водяная баня.

Процедура:

• В одну пробирку наберите 1 мл исследуемого образца, во вторую пробирку наберите 1 мл дистиллированной воды (для отрицательного контроля), в третью пробирку наберите сыворотку альбумин (для положительного контроля).
• Во все три пробирки добавить по 1 мл биуретового реактива и хорошо встряхнуть пробирки.
• Подождите 3-5 минут, затем вы увидите изменение цвета в пробирке с тестовым образцом.

Наблюдение: Если цвет меняется с фиолетового на синий; что показывает наличие белка с более чем двумя пептидными связями. Отсутствие изменения окраски свидетельствует об отсутствии белка. Иногда цвет пробирки может меняться с голубого на розовый, что свидетельствует о наличии очень коротких пептидов или пептонов ^[5] .

2. Тест на нингидрин

Этот метод полезен для обнаружения аминокислот, пептидов и белков в исследуемом образце. Нингидрин реагирует с ɑ-аминогруппой аминокислот и белков.

Принцип: Нингидрин является очень сильным окислителем. Реакция с ɑ-аминогруппой вызывает окислительное дезаминирование аминокислоты с образованием восстановленной формы нингидрина, СО2 и аммиака. Затем восстановленный нингидрин реагирует с выделившимся аммиаком и другим нингидрином, что приводит к образованию комплекса 9 синего цвета.0149 [10] .

Требования: Образец для испытаний, ацетатный буфер, фенол, реагент нингидрин (0,6 г нингидрина, растворенный в 10 мл абсолютного этанола), пипетка и пробирка.

Процедура:

• Возьмите 1 мл исследуемого образца в пробирку.
• Добавьте 0,5 мл буфера и 5,0 мл фенола в пробирку с образцом. Энергично встряхните раствор, чтобы получить прозрачный раствор.
• Затем добавьте в пробирку 0,5 мл нингидринового реагента и хорошо перемешайте.
• Поместите пробирку на водяную баню на 5 минут.
• Затем охладите раствор под водопроводной водой и снова энергично встряхните раствор в течение примерно 30 секунд.
• Раствор фиолетового цвета показывает положительный результат теста. Бледно-желтый цвет раствора свидетельствует об отрицательном результате теста.

Примечание. Из-за отсутствия в пролине свободной ɑ-аминогруппы раствор будет окрашен в желтый цвет ^[10] .

Тесты на аминокислоты и низшие пептиды

1.    Ксантопротеидная реакция

Этот тест используется для проверки присутствия белка, содержащего ароматические аминокислоты, в испытуемом образце.

Принцип: Реакция ароматических аминокислот белка с азотной кислотой при нагревании дает желтую окраску из-за нитрования бензольного кольца. Окрашенный продукт становится оранжевым при добавлении в раствор щелочи.

Требования: Образец для испытаний, азотная кислота (концентрированная HNO3), 40% NaOH

Процедура:

• Возьмите 1 мл исследуемого образца в сухую пробирку. (Вы можете взять дистиллированную воду в качестве отрицательного результата и сывороточный альбумин в качестве положительного контроля в двух разных пробирках).
• Теперь добавьте 1 мл конц. HNo3 в пробирках.
• Нагрейте пробирки над пламенем.
• Охладите пробирки под водопроводной водой (вы можете заметить изменение цвета образца на желтый, если он содержит ароматическую аминокислоту)

Примечание: Фенилаланин может давать отрицательный результат или очень незначительное изменение желтого цвета, хотя он имеет ароматическое кольцо .

• Теперь добавьте 〜2 мл 40% NaOH в пробирку.

(Вы можете наблюдать изменение цвета образца с желтого на оранжевый, что подтверждает присутствие ароматической аминокислоты в неизвестном или содержащем белок образце).

2. Тест Сакагучи (аргининовая реакция)

Этот метод проверяет наличие аргинина в исследуемом образце. Гуанидильная группа содержится в гистонах, протаминах и лизоцимах в очень значительном количестве.

Принцип: Реактив, используемый в этом методе, состоит из ɑ-нафтола и одной капли гипохлорита натрия (иногда его также называют реагентом Сакагучи). ɑ-нафтол реагирует с гуанидильной группой аргинина и полученный продукт окисляется гипохлоритом натрия. Окисление приводит к красному цвету соединения.

Требование: Образец для испытаний, Э-нафтол, гипохлорит натрия, мочевина, пипетки, сухие пробирки.

Процедура:

• Возьмите 5 мг/5 мл исследуемого образца в пробирку.
• Добавьте в пробирку 1 мл 10% NaOH и 1 мл ɑ-нафтола. Хорошо перемешайте раствор.
• Через 5 минут добавьте в пробирку 1 мл гипохлорита натрия и хорошо перемешайте.
• Через 1 минуту после добавления гипохлорита натрия добавьте 2 мл 20% раствора мочевины.
• Тщательно перемешайте раствор, перевернув пробирку.
• Через 2-3 минуты вы можете увидеть раствор красного цвета, что указывает на присутствие аргинина в вашем образце ^[3][2] .

Примечание: Вы можете получить положительный результат этого теста с любым образцом, содержащим гуанидильную группу.

3. Тест Хопкинса-Коула (реакция с триптофаном)

Этот метод проверяет наличие триптофана в образце. Триптофаны обнаружены в проферментах, гонадотропинах и глюкагоне в больших концентрациях.

Принцип: Этот метод основан на реакции присутствующего в образце триптофана с глиоксиловой кислотой в присутствии конц. h3So4, придающий раствору пурпурный цвет.

Требование: Образец для испытаний, реактив Адамкевича (глиоксиловая кислота, получаемая восстановлением щавелевой кислоты порошком магния или амальгамой натрия), конц. h3SO4, сухие пробирки, пипетки.

Процедура:

• Возьмите 2 мл исследуемого образца в пробирку.
• Добавьте в пробирку 1 мл реактива Адамкевича и хорошо перемешайте.
• После добавления реагента медленно вдоль стенки пробирки добавить 1 мл конц. h3SO4.
• Через 2-3 минуты на границе раздела двух растворов можно увидеть кольцо фиолетового цвета, что свидетельствует о наличии триптофана в исследуемом образце.

Триптофан также может быть продемонстрирован с помощью диметиламинобензальдегида (ДМАБ) [7] с последующим связыванием с солью диазония. В этом тесте синий цвет раствора указывает на наличие триптофана в образце.

4. Тест Миллона (тирозиновая реакция)

Этот метод проверяет наличие тирозина в исследуемом образце.

Принцип: Фенольная группа тирозина нитрована азотной кислотой. Затем этот продукт образует комплекс с ртутью (I) и ртутью (II), который придает раствору цвет от розового до кирпично-красного.

Требование: Образец для испытаний, реактив Миллона (раствор азотнокислого азотнокислого ртути), пробирки.

Процедура:

• Набрать 1-2 мл исследуемого образца в пробирку.
• Добавьте 1 мл реактива Миллона в пробирку с образцом и хорошо перемешайте.
• Если изменение цвета не наблюдается, нагрейте раствор до кипения.

Примечание: На этой стадии некоторые белки, содержащие тирозин, приобретают белый цвет, который после нагревания становится красным. Другие белки, содержащие тирозин, также могут сразу окрашиваться в красный цвет.

• Вы можете увидеть раствор цвета красного кирпича, который показывает, что тест положительный. Если изменение цвета не наблюдается, значит, ваш образец не содержит тирозина.

5. Реакция Эллмана (сульфгидрильная реакция)

Этот метод используется для демонстрации наличия свободной сульфгидрильной группы (цистеина) в неизвестном образце или образце белка ^[6] .

Принцип: Свободная сульфгидрильная группа реагирует с DTNB (5,5′-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота), что дает продукт смешанного дисульфида и TNB (2-нитро-5-тиобензойная кислота). TNB образующийся в результате реакции, окрашивает раствор в желтый цвет 9.0007

Требование: Тестовый образец, реактив Эллмана {DTNB+трис-буфер (1M, pH 8)+дистиллированная вода), пипетка и кювета.

Процедура:

• Добавьте в кювету 50 мкл раствора DTNB и 100 мкл трис-буфера, а затем 840 мкл дистиллированной воды (реактив Эллмана). Хорошо перемешайте раствор с помощью пипетки.
• Наконец, добавьте 10 мкл испытуемого образца в ту же кювету, доведя окончательный объем до 1000 мкл. Примечание. Для этого метода можно также напрямую использовать имеющийся в продаже реагент Эллмана.
• Хорошо перемешайте приготовленный раствор с помощью пипетки и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 5 минут.
• Измерьте оптическую плотность раствора при 412 нм.
• Приготовьте различные разведения испытуемого образца и повторите ту же процедуру.
• Для стандартной калибровочной кривой можно использовать ацетат цистеина и повторить те же шаги ^[6] .

 

Применение гистохимических методов для демонстрации белков при патологических состояниях:

Применение белков, демонстрирующих гистохимические методы, широко используется в биомедицинской области для обнаружения и изучения патологических состояний, а также в области исследований для гистологических оценок. Ниже поясняются некоторые применения гистохимических методов на белок в различных биологических исследованиях. Цистеин окислительный и в некоторых восстановительных методах широко используется для изучения этих гормонов и белков-переносчиков.

2.    Клетки Крука-Рассела

Методы демонстрации цистеина можно использовать для изучения клеток Крука-Рассела и базофилов гипофиза, содержащих гранулы, богатые цистеином. Этот метод также может быть использован для изучения болезни Аддисона, для наблюдения за базофилами и для изучения АКТГ.

3.    Меланофор-стимулирующий гормон

Этот гормон увеличивает секрецию меланофоров, из-за чего кожа выглядит темной. Этот гормон богат триптофаном, поэтому демонстрация триптофана в этом состоянии может быть полезна для изучения уровня гормона.

4.    Серотонин (5-гидрокситриптамин)

Этот гормон является производным триптофана и используется для изучения патологических состояний, связанных с гранулами аргентафина (гранулы, богатые серотонином, помогающим пищеварению) и раком (серотонин действует как фактор роста в многие карциномы и глиомы), можно использовать метод демонстрации триптофана в сочетании с методом карболина.

5.    Нейрокератин

Это вещество было впервые выделено из головного мозга и оказалось устойчивым ко многим протеазам. Нейрокератин содержит триптофан в более высоких концентрациях, чем любая другая аминокислота, и богат миелиновой оболочкой. Итак, любое нарушение, связанное с миелиновой оболочкой, можно изучить с помощью триптофана, демонстрирующего гистохимические методы.

6.    Белковая недостаточность

Низкий уровень белка или высокий уровень углеводов влияют на организм по-разному (например, квашиоркор). Это исследование можно провести с помощью методов, которые обнаруживают триптофан (в мышцах) и цистеин, тирозин и аргинин (в эпидермисе).

Заключение

Гистохимические методы для демонстрации белков всегда были важной частью биомедицинских исследований из-за участия белков во всех жизненных процессах. Существует несколько доступных гистохимических методов, которые вносят огромный вклад в изучение различных биологических структур и патологических состояний, таких как квашиоркор, болезнь Аддисона и рак.

 

Ссылки

1. А. Г. Эверсон Пирс (1951). Обзор современных методов гистохимии. Журнал клинической патологии , 1794-1878. doi: 10.1136/jcp.4.1.1
2. Энтони А. Альбанезет и Джейн Э. (1945). Франкстон. Колориметрическое определение аргинина в белковых гидролизатах и ​​моче человека. Журнал биологической химии, 159 , 185-194. doi:  http://www.jbc.org/content/159/1/185.
3. CJ Weber (1930). Модификация реакции Сакагучи для количественного определения аргинина.